化妝品中激素類成分的檢測方法

Determination of Hormone Components in Cosmetics1 范圍

本方法規(guī)定了采用高效液相色譜-質(zhì)譜法測定化妝品中的激素類成分，包括定性與定量。

本方法適用于膏霜乳液類、液態(tài)水基類、液態(tài)油基類、凝膠類、面膜類等化妝品中激素類成分的定性與定量。

2 方法提要

樣品以乙腈為溶劑提取，采用高效液相色譜儀分離，質(zhì)譜檢測器檢測，根據(jù)保留時間和特征離子對的相對豐度比定性、定量離子對峰面積定量，以標準曲線法計算含量。

本方法對63種激素類成分的檢出限、定量下限和取樣量為0.2 g時的檢出濃度、最低定量濃度見表1。

表1 63種激素類成分的檢出限、定量下限、檢出濃度和最低定量濃度3 試劑和材料

除另有規(guī)定外，本方法所用試劑均為分析純或以上規(guī)格，水為GB/T 6682規(guī)定的一級水。

3.1 乙腈：色譜純。

3.2 正己烷：色譜純。

3.3 50%乙腈溶液：取乙腈、水等體積混合，搖勻。

3.4 70%乙腈溶液：取乙腈、水按體積比7:3混合，搖勻。

3.5流動相的配制：

流動相A：水

流動相B：乙腈（3.1）

3.6標準儲備溶液

分別稱取各激素標準品（表1）10 mg（精確到0.00001 g）置于50 mL容量瓶中，加乙腈（3.1）使溶解并定容至刻度。

4 儀器和設(shè)備

4.1液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀。

4.2分析天平。

4.3離心機。

4.4超聲波清洗儀。

4.5渦旋混合儀。

5 分析步驟

5.1混合標準溶液的制備

分別取各激素標準儲備溶液（3.6）適量，用50%乙腈溶液（3.3）配制成濃度在定量下限附近的溶液。

注：實驗室完成分析方法的優(yōu)化后，如能夠保持儀器、色譜條件、質(zhì)譜測定參數(shù)等分析條件固定，測定指標重現(xiàn)性良好，可隨行質(zhì)控標準品溶液代替63種激素混合標準品溶液對分析條件的穩(wěn)定性、結(jié)果的重復性進行控制。如發(fā)生更改儀器、色譜條件、質(zhì)譜條件等情況，均需重新對各組分進行定位。

質(zhì)控標準儲備溶液：稱取曲安奈德、鹵美他松、哈西奈德、地塞米松、地塞米松醋酸酯、氟氫縮松、倍他米松戊酸酯、氯倍他索丙酸酯、環(huán)索奈德、雌二醇、己烯雌酚標準品各約10 mg（精確到0.00001 g）置于100 mL容量瓶中，用乙腈（3.1）溶解并定容至刻度，作為質(zhì)控標準儲備液。置-20℃保存。對于質(zhì)譜響應(yīng)較弱的成分，實驗室可自行增加該成分作為質(zhì)控標準物質(zhì)，以提高篩查準確性。

質(zhì)控標準混合溶液：分別量取質(zhì)控標準儲備溶液適量，用50%乙腈溶液（3.3）配制成濃度在定量下限附近的溶液。5.2 樣品處理

5.2.1 膏霜乳液類、液態(tài)水基類、凝膠類、面膜類樣品

稱取樣品0.2 g（精確到0.001g），置于10 mL具塞比色管中，加入少量乙腈（3.1），在渦旋混合儀上振蕩30s至試樣與提取溶劑混合均勻，然后加入乙腈至近刻度，超聲提取20 min，靜置至室溫，用乙腈（3.1）定容至刻度，搖勻，以4000 r/min離心10 min，濾過（必要時取上清液適量用50%乙腈溶液（3.3）稀釋，稀釋液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾），濾液作為待測溶液。

5.2.2 液態(tài)油基類

稱取樣品0.2 g（精確至0.001g），置于離心管中，加入2 mL正己烷（3.2），在渦旋混合儀上分散，然后加入70%乙腈（3.4）3 mL，渦旋振蕩2 min，4000 r/min離心10 min，吸取下層溶液至10 mL比色管中，上層正己烷層用70%乙腈（3.4）3 mL，自“渦旋振蕩2 min，…”起，重復上述步驟一次，合并兩次溶液，加50%乙腈（3.3）定容至刻度，濾過（必要時用適量50%乙腈溶液（3.3）稀釋，稀釋液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾），濾液作為待測溶液。

5.3儀器參考條件

5.3.1 參考色譜條件

色譜柱： C18柱 （150 ×2.0 mm，2.2 μm），或等效色譜柱。

流動相梯度洗脫程序：流速：0.3 mL/min；

柱溫：40 ℃；

進樣量：10 μL；

5.3.2 質(zhì)譜條件

離子源： 電噴霧離子源（ESI源）；

監(jiān)測模式： 正離子、負離子多離子反應(yīng)監(jiān)測模式，監(jiān)測離子對及相關(guān)參數(shù)設(shè)定見表2。

表2 63種激素類成分監(jiān)測離子對及相關(guān)參數(shù)設(shè)定表注：“*”為定量離子對

5.4 定性

取待測溶液與標準溶液在相同分析條件下測定，樣品中如呈現(xiàn)定量離子對和定性離子對的色譜峰，被測成分的特征離子峰保留時間與標準溶液對應(yīng)的保留時間一致，且選擇的定性離子的相對豐度比與相當濃度標準品溶液的定性離子的相對豐度比的最大偏差不超過表3的規(guī)定，則可以判定樣品中存在對應(yīng)的激素成分。

注：如使用質(zhì)控標準混合溶液，應(yīng)滿足以下質(zhì)控條件：①各成分均檢出相應(yīng)的特征離子對，②特征離子對信噪比SN≥7，③保留時間相對偏差在±3%內(nèi)。當樣品中檢出疑似陽性成分時，應(yīng)隨行相應(yīng)的標準溶液進行確證。

表3 定性判定時離子相對豐度的最大允許偏差5.5 定量

5.5.1 標準儲備溶液的制備

稱取待測激素標準品約10mg（精確到0.00001 g），置100 mL容量瓶中，用乙腈（3.1）使溶解并定容至刻度。

5.5.2系列基質(zhì)標準溶液的制備

取與待測樣品基質(zhì)類型相同空白樣品6份于10 mL比色管中（0.2 g/份），分別加入標準儲備溶液適量，按照“5.2樣品處理”的操作步驟處理，然后用50%乙腈溶液（3.3）配制系列基質(zhì)標準溶液。其中氟氫縮松、鹵美他松、哈西奈德、雌二醇、雌三醇、雌酮濃度為6、10、20、30、40、60 ng/mL，其余組分濃度為 2、4、10、20、40、60 ng/mL（標準溶液濃度范圍可根據(jù)實際情況進行調(diào)整）。

5.5.3 樣品處理：同5.2

5.5.4 測定

取系列基質(zhì)標準溶液依次進樣，記錄定量離子對色譜峰面積并繪制峰面積（A）-濃度（C）標準曲線，其線性相關(guān)系數(shù)r≥0.99。取待測溶液進樣，測得定量離子色譜峰面積，根據(jù)標準曲線得到待測溶液中各成分的濃度，按“6”計算樣品中各成分的含量。

6分析結(jié)果的表述

6.1計算

式中： ω——樣品中激素類組分的質(zhì)量分數(shù)，g/g；

ρ——從標準曲線得到待測組分的質(zhì)量濃度，g/mL；

V——樣品定容體積，mL；

m——樣品取樣量，g；

D——稀釋倍數(shù)（如未稀釋則為1）。

在重復性條件下獲得的兩次獨立測試結(jié)果的絕對差值不得超過算術(shù)平均值的15 %。

6.2 回收率和精密度

多家實驗室驗證定量下限濃度回收率為72.7～122.1%，相對標準偏差小于15%（n=6），其他濃度回收率為80.7～119.6%，相對標準偏差小于11%（n=6）。附錄A

（資料性附錄）

63種激素的中文名稱、英文名稱、CAS號及分子式（來源：國家藥監(jiān)局；編發(fā)：北京天健華成國際投資顧問有限公司化妝品注冊部）